细胞短链烯脂酰辅酶A水合酶活性比色法定量检测试剂盒新品说明书

814 人阅读发布时间：2023-04-05 17:41

脂肪酸β氧化过程（β-oxidation）在动物组织的线粒体发生的脂肪酸代谢通路，可概括为活化、转移、β氧化及最后经三羧酸循环被彻底氧化生成CO2和H2O，并释放能量等四个阶段。短链烯脂酰辅酶A水合酶（short chain enoyl coA hydratase；ECHS；EC4.2.1.17），又称为巴酸酶（crotonase），是脂肪酸代谢进入β-氧化后的第二步催化反应，也是为第二次脂肪酸氧化做准备。短链烯脂酰辅酶A水合酶是一种存在于线粒体和过氧化物体的内膜上的可溶型蛋白，常作为多功能蛋白（multi-functional protein），包括水合酶、异构酶和脱氢酶的一员。在细菌中，还参与聚羟基烷酸酯（Polyhydroxyalkanoate；PHA）的合成。猪的短链烯脂酰辅酶A水合酶由6个亚体构成，155Kd。在烯脂酰辅酶A水合酶的催化下，将脂酰辅酶A，即烯脂酰辅酶A（trans-△²^,3-enoyl CoA）上2和3位碳之间的双键（double bond）裂解，加上OH基团和质子到未饱和脂肪酸脂酰辅酶A的β-碳位上。基于短链烯脂酰辅酶A 4碳巴豆酰辅酶A（crotonyl-CoA）作为底物，在短链烯脂酰辅酶A水合酶的作用下，产生羟脂酰辅酶A （L-3-hydroxyacyl coA）衍生物。由此烯脂酰辅酶A之间的烯硫脂键（enoyl-thiol ester bond）丢失，在分光光度仪下，发生峰值变化（263nm 波长），来定量分析短链烯脂酰辅酶A水合酶的活性。短链烯脂酰辅酶A水合酶反应系统为：

产品内容

HEPENGBIO清理液（Reagent A）毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B）毫升
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）毫升
HEPENGBIO反应液（Reagent D）微升
HEPENGBIO阴性液（Reagent E）毫升
产品说明书 1份

保存方式

保存HEPENGBIO裂解液（Reagent B）和HEPENGBIO反应液（Reagent D）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO反应液（Reagent D）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
微型台式离心机：用于样品操作
比色皿或酶标板：用于比色的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

样品准备

1. 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）
2. 小心加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5. 加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞
6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7. 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混匀
10. 转移到预冷的1.5毫升离心管
11. 强力涡旋震荡15秒
12. 置于冰槽里孵育30分钟
13. 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15. 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）
16. 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

测定准备

开启并设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长263nm，间隔5分钟，读数3次（共15分钟），并置零
从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；HEPENGBIO反应液（Reagent D）避免光照
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

背景对照测定

移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
加入xx微升HEPENGBIO反应液（Reagent D）
上下倾倒数次，混匀
在30℃温度下孵育3分钟
加入xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent E）
上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0分钟读数－15分钟读数）

样品测定

1. 移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入xx微升HEPENGBIO反应液（Reagent D）
3. 上下倾倒数次，混匀
4. 在30℃温度下孵育3分钟
5. 加入5微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）
6. 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7. 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0分钟读数－15分钟读数）

五、计算样品活性

- 酶标板测定

在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
分别移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到96孔板中
分别加入xx微升HEPENGBIO反应液（Reagent D）
轻轻摇动96孔酶标板
在30℃温度下孵育3分钟
分别加入xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent E）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
轻轻摇动酶标板
即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和15分钟读数
活性计算：

注意事项

本产品为20次操作，包括背景对照
操作时，须戴手套
系统操作过程中，背景测定只需1次
建议使用比色皿测定
样品须澄清，至关重要
加样后3秒内比色测定
测定值由高到低变化；测定可持续15分钟
比色测定后，比色皿须清洗彻底
样本测定0分钟读数高于15分钟读数表明具有酶活性
建议待测样本蛋白浓度为100微克/20微升（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）
如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
用户可以使用短链链烯脂酰辅酶A水合酶抑制剂8碳烯脂酰辅酶A（2-octenoyl CoA；4.5微摩尔）作为阴性对照或抑制剂阳性对照
牛的心脏组织短链链烯脂酰辅酶A水合酶活性参考值为145微摩尔/分钟/克，肝脏组织为717微摩尔/分钟/克
短链链烯脂酰辅酶A水合酶单位活性定义为：在30℃，pH 8.0条件下，每分钟内转化1微摩尔巴豆酰辅酶A所需的酶量作为一个活性单位
本公司提供系列脂肪酸代谢检测试剂产品

质量标准

本产品经鉴定性能稳定
本产品经鉴定检测敏感

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