脂类物质（LIPIDS）是一类脂溶性（疏水性）的自然分子，分为简单脂质包括脂肪酸（FATTY ACID）及其衍生物甘油一脂、二脂、三脂；复合脂质包括磷脂、糖脂、硫脂以及脂蛋白；和中性脂质包括甘油、固醇类（STEROL）物质，例如胆固醇。脂类物质在机体中具有能量储存的作用，是膜结构的组成成分和细胞信号分子。尼罗红染色剂（9-diethylamino-5H-benzo[alpha]-phenoxazine-5-one；Nile red）是一种亲脂性的恶嗪类荧光染料。与极性脂类物质，例如磷脂结合后，在特定激发波长543nm的激发下，显示强烈桔红色荧光（散发波长598nm）。其分子式为C20H18N2O2，分子量为318。 

产品内容

HEPENGBIO清理液（Reagent A）  毫升
HEPENGBIO固着液（Reagent B）  毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent C）  微升
HEPENGBIO稀释液（Reagent D）  毫升
产品说明书  1份

保存方式

保存HEPENGBIO染色液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于反应液配制和样品操作的容器
微型台式离心机：用于悬浮细胞的操作
荧光显微镜：用于细胞染色后观察分析

实验步骤

实验开始前，将试剂盒里的HEPENGBIO染色液（Reagent C）冻融，然后移出xx毫升HEPENGBIO稀释液（Reagent D）到1.5毫升离心管，加入xx微升HEPENGBIO染色液（Reagent C），混匀后，置入冰槽里，标记为HEPENGBIO染色工作液，避免光照。然后进行下列操作。

操作一：细胞载玻片染色

1. 取出待测的细胞载玻片  
2. 小心加上xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）在载玻片上，铺满整个样品表面
3. 小心移去载玻片上的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
4. 小心加上xx微升HEPENGBIO固着液（Reagent B），铺满整个样品表面
5. 室温下，孵育5分钟
6. 小心移去载玻片上的HEPENGBIO固着液（Reagent B）
7. 小心加上xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A），清洗样品表面
8. 小心移去载玻片上的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
9. 小心加上xx微升HEPENGBIO染色工作液，铺满整个载玻片样品表面
10. 室温下孵育10分钟，避免光照
11. 放上盖玻片
12. 即刻在荧光显微镜下观察：激发波长543nnm，散发波长598nm（磷脂类物质呈现桔红色）

操作二：24孔细胞培养板染色
 

1. 小心抽去24孔细胞培养板里的培养液
2. 小心加入xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A），清洗生长中的细胞表面
3. 小心抽去HEPENGBIO清理液（Reagent A）
4. 小心加入xx微升HEPENGBIO固着液（Reagent B），覆盖整个生长表面
5. 在室温下孵育5分钟
6. 小心抽去HEPENGBIO固着液（Reagent B）
7. 小心加入xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A），清洗细胞表面
8. 小心抽去HEPENGBIO清理液（Reagent A）
9. 小心加入xx微升HEPENGBIO染色工作液，覆盖整个生长表面
10. 室温下静孵育10分钟，避免光照
11. 即刻在荧光显微镜下观察：激发波长543nnm，散发波长598nm（磷脂类物质呈现桔红色）

操作三：悬浮细胞或脱离细胞染色
 

1. 将悬浮细胞或脱离细胞（1 X 10⁶细胞）移入到1.5毫升离心管
2. 放进微型台式离心机离心1分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
3. 小心抽去上清液
4. 加入xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
5. 放进微型台式离心机离心1分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
6. 小心抽去上清液
7. 加入xx微升HEPENGBIO染色工作液，混匀细胞颗粒群
8. 室温下孵育10分钟，避免光照
9. 移出50微升到载玻片上，放上盖玻片
10. 即刻在荧光显微镜下进行观察：激发波长543nnm，散发波长598nm（磷脂类物质呈现桔红色）

注意事项
 

1. 本产品为50次（细胞载玻片）和25次（1个24孔板）操作
2. 操作时，须戴手套
3. 所有操作在室温下进行
4. 本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和各种培养孔板，须相应调整处理液：

操作容器	建议操作体系
载玻片	200微升
载玻片培养皿	1毫升
35mm培养皿	1毫升
96孔培养板	100微升
48孔培养板	200微升
24孔培养板	400微升
12孔培养板	1毫升
6孔培养板	2毫升
25cm2细胞培养瓶	3毫升

1. HEPENGBIO染色工作液新鲜配制，即刻使用，不宜保存
2. HEPENGBIO染色液（Reagent C）的工作液使用比例：1毫升体系可以使用10微升（1：100容量比）
3. 每次更换试剂溶液时，保持样品表面基本晾干。空气中晾干状态为没有水滴，呈湿润状态，可见反光
4. 试剂溶液在样品表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满细胞表面
5. 如果用户没有匹配的滤波器，可以使用515至560nm之间的任一激发波长和590至610nm之间的任一散发波长
6. 染色完成后，即刻进行荧光显微镜观察
7. 本公司提供系列脂类染色试剂产品